Kromatografi cecair adalah kaedah utama untuk menguji kandungan setiap komponen dan kekotoran dalam bahan mentah, perantaraan, penyediaan dan bahan pembungkusan, tetapi banyak bahan tidak mempunyai kaedah standard untuk bergantung, jadi tidak dapat dielakkan untuk membangunkan kaedah baru. Dalam pembangunan kaedah fasa cecair, lajur kromatografi adalah teras kromatografi cecair, jadi cara memilih lajur kromatografi yang sesuai adalah penting. Dalam artikel ini, penulis akan menerangkan cara memilih lajur kromatografi cecair daripada tiga aspek: idea keseluruhan, pertimbangan dan skop aplikasi.
A. Idea keseluruhan untuk memilih lajur kromatografi cecair
1. Menilai sifat fizikal dan kimia analit: seperti struktur kimia, keterlarutan, kestabilan (seperti sama ada ia mudah untuk dioksidakan/dikurangkan/dihidrolisis), keasidan dan kealkalian, dsb., terutamanya struktur kimia adalah kunci. faktor dalam menentukan sifat, seperti kumpulan terkonjugasi mempunyai penyerapan ultraviolet yang kuat dan pendarfluor yang kuat;
2. Tentukan tujuan analisis: sama ada pemisahan tinggi, kecekapan lajur tinggi, masa analisis pendek, kepekaan tinggi, rintangan tekanan tinggi, hayat lajur yang panjang, kos rendah, dan lain-lain diperlukan;
- Pilih lajur kromatografi yang sesuai: fahami komposisi, sifat fizikal dan kimia pengisi kromatografi, seperti saiz zarah, saiz liang, toleransi suhu, toleransi pH, penjerapan analit, dsb.
- Pertimbangan untuk memilih lajur kromatografi cecair
Bab ini akan membincangkan faktor-faktor yang perlu dipertimbangkan semasa memilih lajur kromatografi dari perspektif sifat fizikal dan kimia lajur kromatografi itu sendiri. 2.1 Matriks pengisi
2.1.1 Matriks gel silika Matriks pengisi kebanyakan lajur kromatografi cecair ialah gel silika. Pengisi jenis ini mempunyai ketulenan yang tinggi, kos rendah, kekuatan mekanikal yang tinggi, dan mudah untuk mengubah suai kumpulan (seperti ikatan fenil, ikatan amino, ikatan siano, dll.), tetapi nilai pH dan julat suhu yang diterimanya adalah terhad: Julat pH kebanyakan pengisi matriks gel silika ialah 2 hingga 8, tetapi julat pH fasa terikat gel silika yang diubah suai khas boleh selebar 1.5 hingga 10, dan terdapat juga fasa terikat gel silika yang diubah suai khas yang stabil pada pH rendah, seperti Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, yang stabil pada pH 1 hingga 8; had suhu atas matriks gel silika biasanya 60 ℃, dan beberapa lajur kromatografi boleh bertolak ansur dengan suhu 40 ℃ pada pH tinggi.
2.1.2 Matriks polimer Pengisi polimer kebanyakannya polistirena-divinilbenzena atau polimetakrilat. Kelebihannya ialah ia boleh bertolak ansur dengan julat pH yang luas – ia boleh digunakan dalam julat 1 hingga 14, dan ia lebih tahan terhadap suhu tinggi (boleh mencapai melebihi 80 °C). Berbanding dengan pengisi C18 berasaskan silika, pengisi jenis ini mempunyai hidrofobisiti yang lebih kuat, dan polimer makroporous sangat berkesan dalam mengasingkan sampel seperti protein. Kelemahannya ialah kecekapan lajur lebih rendah dan kekuatan mekanikal lebih lemah daripada pengisi berasaskan silika. 2.2 Bentuk zarah
Kebanyakan pengisi HPLC moden adalah zarah sfera, tetapi kadangkala ia adalah zarah tidak teratur. Zarah sfera boleh memberikan tekanan lajur yang lebih rendah, kecekapan lajur yang lebih tinggi, kestabilan dan hayat yang lebih lama; apabila menggunakan fasa mudah alih berkelikatan tinggi (seperti asid fosforik) atau apabila larutan sampel adalah likat, zarah tidak sekata mempunyai kawasan permukaan khusus yang lebih besar, yang lebih kondusif untuk tindakan penuh kedua-dua fasa, dan harganya agak rendah. 2.3 Saiz zarah
Semakin kecil saiz zarah, semakin tinggi kecekapan lajur dan semakin tinggi pemisahan, tetapi semakin teruk rintangan tekanan tinggi. Lajur yang paling biasa digunakan ialah lajur saiz zarah 5 μm; jika keperluan pemisahan adalah tinggi, pengisi 1.5-3 μm boleh dipilih, yang kondusif untuk menyelesaikan masalah pemisahan beberapa matriks kompleks dan sampel berbilang komponen. UPLC boleh menggunakan pengisi 1.5 μm; Pengisi saiz zarah 10 μm atau lebih besar selalunya digunakan untuk lajur separuh persediaan atau persediaan. 2.4 Kandungan karbon
Kandungan karbon merujuk kepada perkadaran fasa terikat pada permukaan gel silika, yang berkaitan dengan luas permukaan tertentu dan liputan fasa terikat. Kandungan karbon yang tinggi memberikan kapasiti lajur yang tinggi dan resolusi tinggi, dan sering digunakan untuk sampel kompleks yang memerlukan pemisahan yang tinggi, tetapi disebabkan oleh masa interaksi yang panjang antara dua fasa, masa analisis adalah panjang; lajur kromatografi kandungan karbon rendah mempunyai masa analisis yang lebih pendek dan boleh menunjukkan selektiviti yang berbeza, dan sering digunakan untuk sampel mudah yang memerlukan analisis pantas dan sampel yang memerlukan keadaan fasa akueus yang tinggi. Secara amnya, kandungan karbon C18 berkisar antara 7% hingga 19%. 2.5 Saiz liang dan luas permukaan tertentu
Media penjerapan HPLC adalah zarah berliang, dan kebanyakan interaksi berlaku di dalam liang. Oleh itu, molekul mesti memasuki liang untuk diserap dan diasingkan.
Saiz liang dan luas permukaan tertentu adalah dua konsep pelengkap. Saiz liang kecil bermakna luas permukaan khusus yang besar, dan sebaliknya. Kawasan permukaan khusus yang besar boleh meningkatkan interaksi antara molekul sampel dan fasa terikat, meningkatkan pengekalan, meningkatkan muatan sampel dan kapasiti lajur, dan pengasingan komponen kompleks. Pengisi berliang penuh tergolong dalam jenis pengisi ini. Bagi mereka yang mempunyai keperluan pemisahan yang tinggi, disyorkan untuk memilih pengisi dengan luas permukaan khusus yang besar; kawasan permukaan tertentu yang kecil boleh mengurangkan tekanan belakang, meningkatkan kecekapan lajur, dan mengurangkan masa keseimbangan, yang sesuai untuk analisis kecerunan. Pengisi kulit teras tergolong dalam jenis pengisi ini. Pada premis untuk memastikan pemisahan, adalah disyorkan untuk memilih pengisi dengan luas permukaan khusus yang kecil bagi mereka yang mempunyai keperluan kecekapan analisis yang tinggi. 2.6 Isipadu liang dan kekuatan mekanikal
Isipadu liang, juga dikenali sebagai "isipadu liang", merujuk kepada saiz isipadu lompang per unit zarah. Ia juga boleh mencerminkan kekuatan mekanikal pengisi. Kekuatan mekanikal pengisi dengan isipadu liang besar sedikit lebih lemah daripada pengisi dengan isipadu liang kecil. Pengisi dengan isipadu liang kurang daripada atau sama dengan 1.5 mL/g kebanyakannya digunakan untuk pengasingan HPLC, manakala pengisi dengan isipadu liang lebih besar daripada 1.5 mL/g digunakan terutamanya untuk kromatografi pengecualian molekul dan kromatografi tekanan rendah. 2.7 Kadar pengehadan
Capping boleh mengurangkan puncak ekor yang disebabkan oleh interaksi antara sebatian dan kumpulan silanol yang terdedah (seperti ikatan ionik antara sebatian alkali dan kumpulan silanol, daya van der Waals dan ikatan hidrogen antara sebatian berasid dan kumpulan silanol), dengan itu meningkatkan kecekapan lajur dan bentuk puncak. . Fasa terikat tidak bertutup akan menghasilkan selektiviti berbeza berbanding fasa terikat berhad, terutamanya untuk sampel kutub.
- Skop penggunaan lajur kromatografi cecair yang berbeza
Bab ini akan menerangkan skop penggunaan pelbagai jenis lajur kromatografi cecair melalui beberapa kes.
3.1 Lajur kromatografi C18 fasa terbalik
Lajur C18 ialah lajur fasa terbalik yang paling biasa digunakan, yang boleh memenuhi kandungan dan ujian kekotoran kebanyakan bahan organik, dan boleh digunakan untuk bahan kutub sederhana, kutub lemah dan bukan kutub. Jenis dan spesifikasi lajur kromatografi C18 hendaklah dipilih mengikut keperluan pengasingan khusus. Sebagai contoh, untuk bahan dengan keperluan pemisahan yang tinggi, spesifikasi 5 μm*4.6 mm*250 mm sering digunakan; untuk bahan dengan matriks pemisahan kompleks dan kekutuban yang serupa, spesifikasi 4 μm*4.6 mm*250 mm atau saiz zarah yang lebih kecil boleh digunakan. Sebagai contoh, penulis menggunakan lajur 3 μm * 4.6 mm * 250 mm untuk mengesan dua kekotoran genotoksik dalam API celecoxib. Pemisahan kedua-dua bahan boleh mencapai 2.9, yang sangat baik. Di samping itu, di bawah premis memastikan pemisahan, jika analisis pantas diperlukan, lajur pendek 10 mm atau 15 mm sering dipilih. Sebagai contoh, apabila pengarang menggunakan LC-MS/MS untuk mengesan kekotoran genotoksik dalam piperaquine phosphate API, lajur 3 μm*2.1 mm*100 mm telah digunakan. Pemisahan antara kekotoran dan komponen utama ialah 2.0, dan pengesanan sampel boleh diselesaikan dalam masa 5 minit. 3.2 Lajur fenil fasa terbalik
Lajur fenil juga merupakan jenis lajur fasa terbalik. Lajur jenis ini mempunyai selektiviti yang kuat untuk sebatian aromatik. Jika tindak balas sebatian aromatik yang diukur oleh lajur C18 biasa adalah lemah, anda boleh mempertimbangkan untuk menggantikan lajur fenil. Contohnya, semasa saya membuat API celecoxib, tindak balas komponen utama yang diukur oleh lajur fenil pengeluar yang sama dan spesifikasi yang sama (semua 5 μm*4.6 mm*250 mm) adalah kira-kira 7 kali ganda daripada lajur C18. 3.3 Lajur fasa biasa
Sebagai tambahan yang berkesan kepada lajur fasa terbalik, lajur fasa normal sesuai untuk sebatian yang sangat polar. Jika puncak masih sangat cepat apabila mengelusi dengan lebih daripada 90% fasa akueus dalam lajur fasa terbalik, malah hampir dan bertindih dengan puncak pelarut, anda boleh mempertimbangkan untuk menggantikan lajur fasa biasa. Lajur jenis ini termasuk lajur hilik, lajur amino, lajur siano, dsb.
3.3.1 Lajur hilik Lajur hilik biasanya membenamkan kumpulan hidrofilik dalam rantai alkil terikat untuk meningkatkan tindak balas kepada bahan polar. Lajur jenis ini sesuai untuk analisis bahan gula. Penulis menggunakan lajur jenis ini apabila melakukan kandungan dan bahan berkaitan xilosa dan terbitannya. Isomer bagi terbitan xilosa juga boleh diasingkan dengan baik;
3.3.2 Lajur amino dan lajur siano Lajur amino dan lajur siano merujuk kepada pengenalan pengubahsuaian amino dan siano masing-masing pada penghujung rantai alkil terikat, untuk meningkatkan selektiviti bagi bahan khas: contohnya, lajur amino ialah pilihan yang baik. untuk pengasingan gula, asid amino, bes, dan amida; lajur cyano mempunyai selektiviti yang lebih baik apabila mengasingkan bahan serupa struktur terhidrogenasi dan tidak terhidrogenasi kerana kehadiran ikatan terkonjugasi. Lajur amino dan lajur siano selalunya boleh ditukar antara lajur fasa biasa dan lajur fasa terbalik, tetapi penukaran kerap tidak disyorkan. 3.4 Lajur kiral
Lajur kiral, seperti namanya, sesuai untuk pengasingan dan analisis sebatian kiral, terutamanya dalam bidang farmaseutikal. Lajur jenis ini boleh dipertimbangkan apabila lajur fasa songsang konvensional dan lajur fasa biasa tidak dapat mencapai pemisahan isomer. Sebagai contoh, pengarang menggunakan lajur kiral 5 μm*4.6 mm*250 mm untuk memisahkan dua isomer 1,2-diphenylethylenediamine: (1S, 2S)-1, 2-diphenylethylenediamine dan (1R, 2R)-1, 2 -diphenylethylenediamine, dan pemisahan antara keduanya mencapai kira-kira 2.0. Walau bagaimanapun, lajur kiral lebih mahal daripada jenis lajur lain, biasanya 1W+/keping. Sekiranya terdapat keperluan untuk lajur sedemikian, unit perlu membuat belanjawan yang mencukupi. 3.5 Lajur pertukaran ion
Lajur pertukaran ion sesuai untuk pengasingan dan analisis ion bercas, seperti ion, protein, asid nukleik, dan beberapa bahan gula. Mengikut jenis pengisi, ia dibahagikan kepada lajur pertukaran kation, lajur pertukaran anion, dan lajur pertukaran kation kuat.
Lajur pertukaran kation termasuk lajur berasaskan kalsium dan berasaskan hidrogen, yang terutamanya sesuai untuk analisis bahan kationik seperti asid amino. Sebagai contoh, penulis menggunakan lajur berasaskan kalsium apabila menganalisis kalsium glukonat dan kalsium asetat dalam larutan pembilasan. Kedua-dua bahan mempunyai tindak balas yang kuat pada λ=210nm, dan tahap pemisahan mencapai 3.0; penulis menggunakan lajur berasaskan hidrogen semasa menganalisis bahan berkaitan glukosa. Beberapa bahan berkaitan utama - maltosa, maltotriosa dan fruktosa - mempunyai kepekaan yang tinggi di bawah pengesan pembezaan, dengan had pengesanan serendah 0.5 ppm dan tahap pemisahan 2.0-2.5.
Lajur pertukaran anion terutamanya sesuai untuk analisis bahan anionik seperti asid organik dan ion halogen; lajur pertukaran kation yang kuat mempunyai kapasiti pertukaran ion yang lebih tinggi dan selektiviti, dan sesuai untuk pengasingan dan analisis sampel kompleks.
Di atas hanyalah pengenalan kepada jenis dan julat aplikasi beberapa lajur kromatografi cecair biasa yang digabungkan dengan pengalaman pengarang sendiri. Terdapat jenis lajur kromatografi khas lain dalam aplikasi sebenar, seperti lajur kromatografi berliang besar, lajur kromatografi liang kecil, lajur kromatografi pertalian, lajur kromatografi pelbagai mod, lajur kromatografi cecair berprestasi ultra tinggi (UHPLC), lajur kromatografi cecair superkritikal ( SFC), dsb. Mereka memainkan peranan penting dalam bidang yang berbeza. Jenis khusus lajur kromatografi hendaklah dipilih mengikut struktur dan sifat sampel, keperluan pengasingan dan tujuan lain.
Masa siaran: Jun-14-2024